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哺乳动物msgRNA表达慢病毒载体 |
| 时间：2023-05-16 类别： 其它资讯 |
CRISPR/Cas9载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一，可以快速**地在基因组的靶位点产生突变（另外两种应用广泛的是ZFN和TALEN）。 Cas9属于RNA引导的DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予**对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抗性。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。 协同**介质（SAM）系统是用于转录**内源性基因的强大工具。该系统源自CRISPR/Cas9基因组编辑系统，但不具有基因组编辑功能，是一种可指导在靶位点进行多组分转录**复合物（SAM复合物）组装的修饰型gRNA。通常，SAM复合物的组装足以诱导靶位点强烈的转录**。 完整的SAM系统包含三个组分，每个组分分别由单独的慢病毒载体提供：gRNA/MS2表达载体，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64辅助载体。 将用户定制的gRNA序列克隆到gRNA/MS表达载体。在该载体中，经修饰的gRNA包括两个138-nt发夹RNA适体，形成噬菌体MS2衣壳蛋白的结合位点。这些发夹RNA适体与gRNA连接，有利于**募集MS2-融合蛋白。 MS2/P65/HSF1辅助载体驱动由MS2，p65（NF-kB的反式**亚基）和HSF1（人热休克因子1的**结构域）组成的三结构域融合蛋白的表达。 dCas9/VP64辅助载体驱动催化失活变体dCas9和合成型VP64反式**结构域融合蛋白的表达。 当这三种载体共转导细胞时，用户定制的gRNA可能会募集MS2/P65/HSF1（通过MS2结合发夹适体与gRNA连接）和dCas9/VP64（通过CRISPR/Cas9复合物组装） 到gRNA靶位点，从而组装出强大的SAM复合物。 这些SAM复合物可通过VP64，p65和HSF1**结构域之间的协同相互作用实现靶位点的强烈转录**。 该载体系统主要设计用于基因组的大规模筛选，使用gRNA序列文库来产生gRNA/MS2表达载体文库。同时，该系统也可用于**单个或一系列基因的转录。 优势 内源基因组背景：SAM系统可以**内源基因组靶位点的转录。与转基因和基因编辑技术不同，该技术方法不会涉及改变靶基因位点基因组序列。 独立的调控手段: 使用SAM载体系统靶向转录**基因并不需要预先了解目的基因的天然调控机理，但需要知道靶位点DNA序列的准确信息。 强烈**：使用SAM系统转录**的基因通常得到非常高水平的表达。 不足之处 技术复杂：使用慢病毒载体时，需要在包装细胞中产生活病毒，然后测定病毒滴度。因此慢病毒转染相对于常规质粒转染，技术难度更高，周期更长。 需要多个载体：该载体系统需要gRNA/MS2、MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64共表达，并且这些组分归属于不同的载体。 特异性：基于SAM的基因靶向**方法相对较新，目前还没有关于使用gRNA/MS2 RNA靶向特异性的详细报道。 资讯来源：云舟生物 |
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