在过去几年中基于慢病毒载体的基因治疗数目逐年递增,因此对慢病毒载体的生产纯化工艺也提出了更高的要求,其中慢病毒的活性受到工艺过程中温度、pH、离子强度以及剪切力的影响,因此在下游纯化过程中需要格外关注这些条件对慢病毒载体活性的影响。
慢病毒(LV)下游纯化的策略,包括:澄清过滤,阴离子交换层析、亲和层析、切向流过滤、尺寸排阻色谱、混合模式层析
1.澄清过滤
澄清过滤的主要目的是去除介质中的细胞以及细胞碎片,该工艺中主要有如下两种工艺单元,(1):深层过滤;(2):死端过滤;(3)低速离心。其中将低速离心和过滤相结合的方式最为常见,这样的组合和**减少滤器堵塞适用于中试及以上规模澄清过滤。
从收率的角度来看,经过合理优化后(缓冲液pH、cond以及滤器的选型等)可获得较高的收率,有研究表明在使用深层过滤纯化含有VSV-G的LV时候**收率可达**。此外有研究表明将下游纯化的澄清工艺级联到上游培养工艺中,可获得更优的收益,有研究人员使用切向流深度过滤(TFDF)技术来处理悬浮培养获得的LV从而获得了更好的收率。
2.核酸去除
为提高产品的安全性以及符合相关法规标准,因此必须在纯化工艺中使用一定的策略去除核酸。Benzonase 以及 Denarase 两款酶的使用可以**降低DNA分子大小并且降低产品粘度。这些酶需要Mg离子作为辅助因子参与催化反应,并且在37℃的条件下展现出**的活性(但是反应体系中酶添加量、pH、Cond、是否有抑制剂的存在均会影响催化活性)。部分案例中核酸去除工艺可先于样品澄清过滤,这通常需要使用更高量的核酸酶,需要在后续的纯化工艺中评估核酸酶的去除效果。
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资讯来源:https://www.vectorbuilder.cn/products-services/service/lentivirus-packaging.html
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